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影響默克限制性內(nèi)切酶活性的因素總結(jié),快收藏吧

更新時(shí)間:2021-04-16   點(diǎn)擊次數(shù):1426次
   默克限制性內(nèi)切酶是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶(DNase),它們的切點(diǎn)大多很嚴(yán)格,要求專一的核苷酸順序——識(shí)別順序。長(zhǎng)期以來,難以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段來分析。限制性核酸酶的發(fā)現(xiàn),為基因結(jié)構(gòu)、DNA堿基順序分析和基因工程的研究開辟了途徑。
  能將外來的DNA切斷,即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力,但對(duì)自己的DNA卻無損害作用,這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的,故名默克限制性內(nèi)切酶。
  影響內(nèi)切酶活性的因素有多種,稍有不慎,可能就會(huì)導(dǎo)致酶切反應(yīng)的失敗,除了常見的底物濃度、反應(yīng)溫度等因素,還有以下三種需額外注意。
  1、保護(hù)堿基
  酶蛋白在進(jìn)行切割時(shí),需占據(jù)識(shí)別位點(diǎn)兩邊的若干個(gè)堿基,被稱為保護(hù)堿基。
  2、質(zhì)粒高級(jí)結(jié)構(gòu)
  部分默克限制性內(nèi)切酶無法切割高級(jí)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒,這時(shí)候就需適當(dāng)加大酶的使用量,或用可適應(yīng)高級(jí)結(jié)構(gòu)的限制酶線性化質(zhì)粒后再行切割。
  3、甲基化保護(hù)
  甲基化是細(xì)菌用來保護(hù)自己的基因序列不被內(nèi)源性內(nèi)切酶切割的一種機(jī)制。常見甲基化:Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+與CpG(真核細(xì)胞)等。在實(shí)驗(yàn)中一定要注意宿主細(xì)胞的甲基化信息。
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